Notícias

May 17, 2024

Transcrição reversa

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 11470 (2023) Citar este artigo 9845 Acessos 4 detalhes da Altmetric Metrics O procedimento ilustrado neste artigo representa um novo método para transcriptoma

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 11470 (2023) Citar este artigo

9845 acessos

4 Altmétrico

Detalhes das métricas

O procedimento ilustrado neste artigo representa um novo método para análise do transcriptoma por PCR (Polymerase Chain Reaction), que contorna a necessidade de eliminação de potencial contaminação de DNA. Comparado às metodologias existentes, nosso método é mais preciso, mais simples e reprodutível porque preserva a integridade do RNA, não requer materiais e/ou reagentes que são utilizados para eliminação de DNA e também reduz o número de amostras que devem ser definidas como controles negativos. Este novo procedimento envolve a utilização de um iniciador especificamente modificado durante a etapa de transcrição reversa, que contém bases incompatíveis, produzindo assim moléculas de cDNA que diferem do DNA genômico. Ao utilizar o mesmo iniciador modificado na amplificação por PCR, apenas o modelo de ADNc é amplificado, uma vez que o modelo de ADN genómico é parcialmente heterólogo ao iniciador. Desta forma, a amplificação por PCR não é afectada por qualquer potencial contaminação de ADN, uma vez que é específica apenas para o modelo de ADNc. Além disso, reflete com precisão a concentração inicial de RNA da amostra, que está sujeita a alterações devido a diversos tratamentos físicos ou enzimáticos comumente utilizados pelas metodologias atuais para eliminação de DNA. O método é particularmente adequado para quantificação de transcritos de DNA altamente repetitivos, como DNA satélite.

A análise qualitativa e/ou quantitativa de transcritos por amplificação por PCR é um método de escolha tanto em pesquisas de biologia molecular quanto em diagnósticos médicos1. É amplamente utilizado para detectar e quantificar muitos tipos diferentes de transcritos, como RNA mensageiro, RNA ribossômico, RNA não codificante, etc. As aplicações mais comuns incluem análise de expressão gênica e identificação precisa de um microrganismo específico.

Para ser devidamente analisado, o RNA purificado é submetido a uma etapa preliminar e fundamental de transcrição reversa, por meio da qual as moléculas de RNA são convertidas em cDNA (DNA complementar) pela enzima transcriptase reversa. Na verdade, o próprio RNA não pode ser amplificado diretamente durante as etapas subsequentes de PCR e deve necessariamente ser convertido em cDNA1. O principal problema da maioria dos protocolos utilizados atualmente reside na frequentemente presente contaminação do DNA, que é impossível de diferenciar quimicamente em nível estrutural do cDNA pela enzima polimerase durante a amplificação por PCR, causando resultados falsos positivos2,3,4,5, 6,7. Para superar esta limitação, todos os protocolos atuais incluem algumas etapas de eliminação de DNA, tanto durante a purificação do RNA quanto na subsequente etapa de transcrição reversa. Em ambos os casos o DNA seria eliminado, seja com auxílio de filtros mecânicos específicos (colunas à base de sílica) ou por digestão enzimática por uma enzima específica, como a DNase I (Desoxirribonuclease I)8. Contudo, estes tratamentos não são 100% eficazes para remoção de DNA, que muitas vezes permanece como contaminação de DNA2,3. Este é particularmente o caso do ADN altamente repetitivo que constitui uma parte substancial do genoma eucariótico e é frequentemente transcrito em níveis baixos. Além disso, deve-se enfatizar que qualquer procedimento implementado para reduzir a concentração de DNA na amostra certamente também provoca a redução da concentração inicial do próprio RNA, uma molécula que é por sua própria natureza instável e facilmente degradável.

Aqui relatamos um novo método para análise do transcriptoma por PCR, em que o cDNA e o DNA são diferenciados e, portanto, a contaminação por este último é excluída, produzindo assim resultados mais precisos, confiáveis ​​e reprodutíveis.

Os primers direto, reverso e modificado usados ​​para testar o novo protocolo são ilustrados na Tabela 1. O primer específico modificado difere em relação aos primers direto e reverso não modificados em apenas quatro alterações de base (mutações pontuais) distribuídas alternativamente com nucleotídeos inalterados e começando no Extremidade 3' do primer (marcada em negrito na Tabela 1).