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Mar 23, 2024

CRISPR/Cas12a combinado com RPA para detecção de T. gondii em sangue total de camundongos

Parasitas e Vetores volume 16, Artigo número: 256 (2023) Citar este artigo 280 Acessos 1 Detalhes da Altmetric Metrics Toxoplasma gondii é um protozoário oportunista onipresente em humanos e

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 256 (2023) Citar este artigo

280 acessos

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Toxoplasma gondii é um protozoário oportunista onipresente em humanos e animais. Pode invadir qualquer órgão humano e causar doenças graves, incluindo oftalmopatia por toxoplasma, meningoencefalite e necrose hepática. A toxoplasmose suína é prevalente na China. Os sistemas CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e Cas (CRISPR-Associated Protein) são amplamente utilizados para edição de genes e detecção de patógenos. Os diagnósticos baseados em CRISPR são ensaios moleculares que foram desenvolvidos para detectar parasitas com alta sensibilidade e especificidade.

Este estudo teve como objetivo estabelecer um método combinado de detecção rápida CRISPR/Cas12a e RPA para T. gondii, visando o gene B1 e o elemento de repetição de 529 pb (529 RE). Os resultados da detecção podem ser visualizados pela fluorescência ou pelas tiras de fluxo lateral (LFS). A sensibilidade e especificidade do método foram avaliadas, e sangue de camundongo infectado por T. gondii foi utilizado para detecção.

Os resultados indicaram que o método estabelecido para detecção de T. gondii foi satisfatório, com limite de detecção de 1,5 cp/μl para os dois locos. Além disso, o gene B1 poderia detectar 1 taquizoíto por reação, e o 529 RE poderia detectar 0,1 taquizoíto por reação, consistentemente com os resultados altamente sensíveis da reação em cadeia da polimerase aninhada (PCR). O método foi adequado para cepas, incluindo RH, e não apresentou reação cruzada com DNA de outros protozoários com hábitos semelhantes. As amostras de sangue de camundongos infectados por T. gondii foram todas positivas para T. gondii 1, 3 e 5 dias após a infecção (dpi).

Este estudo estabeleceu um método de detecção de DNA rápido, sensível e econômico para T. gondii que tem o potencial de ser uma ferramenta alternativa para a detecção de T. gondii em campo.

A toxoplasmose é uma doença humano-animal causada por um parasita intracelular especializado, Toxoplasma gondii, com distribuição mundial [1]. O Toxoplasma gondii gondii pode infectar todos os animais de sangue quente, incluindo humanos [2]. Em indivíduos imunocompetentes, a infecção por T. gondii pode causar sintomas semelhantes aos da gripe que persistem por semanas a meses antes de desaparecerem. No entanto, indivíduos imunocomprometidos, como aqueles com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), idosos e aqueles que tomam medicamentos imunossupressores, correm maior risco de doença grave e até morte após infecção por T. gondii [3]. Mulheres grávidas infectadas com T. gondii também correm risco de toxoplasmose congênita no feto, o que pode levar a uma série de resultados adversos, como aborto, malformação ou natimorto [4]. A taxa sorológica positiva de T. gondii em humanos em algumas regiões da China foi relatada como sendo tão alta quanto 23,41%, indicando que a infecção é generalizada no país [5]. Além do seu impacto na saúde humana, o T. gondii tem um impacto significativo na pecuária, com estudos mostrando que a soroprevalência global do T. gondii em suínos é de 19% [6]. A infecção por T. gondii em suínos pode apresentar uma série de sintomas, incluindo febre perdida, diarreia, edema pulmonar e aborto em porcas. Dado que a carne suína é a principal fonte de carne para humanos, a toxoplasmose suína aumenta a possibilidade de infecção humana por T. gondii. A prevenção e o rastreio do T. gondii estão a tornar-se cada vez mais importantes. No entanto, a falta de sintomas clínicos específicos da toxoplasmose representa um desafio para o diagnóstico, destacando a necessidade do desenvolvimento de métodos de detecção mais eficazes do T. gondii.

A detecção do Toxoplasma gondii gondii pode ser alcançada através de uma variedade de métodos, incluindo técnicas etiológicas, imunológicas e moleculares. Os métodos etiológicos, como esfregaços de líquido peritoneal e coloração de cortes histológicos, são demorados e apresentam uma alta taxa de falsos negativos. Os testes imunológicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA), são os métodos mais comuns para detectar a toxoplasmose. Embora o ELISA seja simples e rápido, os pacientes no período de janela de infecção podem passar despercebidos e existem vários fatores interferentes, como o fator reumatóide [7]. Além disso, pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC) e hipogamaglobulinemia secundária podem produzir resultados falso-negativos devido à sua incapacidade de produzir anticorpos IgG [8]. Na biologia molecular, a tecnologia PCR é a mais utilizada. Burg et al. utilizou com sucesso a tecnologia de PCR para detectar DNA de T. gondii no sangue usando o gene B1 como gene alvo no século XX [9]. O uso de genes conservados, como o gene P30 e o gene SAG1, tem tido sucesso na detecção de T. gondii [10, 11]. A PCR quantitativa (Q-PCR) é um derivado útil da PCR que pode ser usada para análises qualitativas e quantitativas. Porém, o Q-PCR requer instrumentos caros e precisos, limitando seu uso ao laboratório, tornando-o inadequado para aplicações em campo.